一．提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl 100%酒精充分混匀，静置5min(RT), 2000×g , 4℃离心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl异丙醇, 混匀,静置10min(RT), 12000×g, 4℃离心10min, 弃上清 , 加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀, 用加样器打散沉淀, 混旋20~30秒, 静置20min(RT) , 7500×g, 4℃离心5min , 弃上清 , 重新加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次, 重悬沉淀 , 离心后弃上清,加入100%无水乙醇 1ml , 混旋1min , 静置20min(RT), 7500×g, 4℃离心5min , 弃上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g, 离心10min,去除沉渣。
二．蛋白定量
1. 取PBS、各样品10 ul，加DW 990 ul
2. 取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5 ml。
3. 向各管加入2.5 ml D试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5ml A－2%Na2CO3、0.1N NaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4. 迅速加入酚试剂0.25ml，混匀 37℃ 水浴30分钟。
5. 721分光光度计650 nm，比色，S0标准管调零。
6. 最后稀释为4 ug /ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug / ul，上样量为30～80ug / 泳道。
三．电泳
1. make gel．
11%分离胶 12ml 两块胶 4%积层胶6ml两块胶
DW 4.36 ml DW 堵漏 3.66ml
3M Tris 3.0 ml 0.5M Tris 1.5 ml
30%Arc 4.4 ml 30%Arc 0.5 ml 0.78 ml
10%SDS 0.24 ml 10%SDS 60 ul
10%APS 0.12 ml 10%APS 20ul 30 ul
TEMED 10ul TEMED 5ul 6ul
2. 上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30 S。
3. 通电电： 积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4. 考马斯亮蓝染色： 1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四．电转印
1. 将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2. 转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五．杂交
1. 取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2. NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6% non－fat milk的pH7.2的PBS中封闭，室温 ６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3. 将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4. 加入一抗 1:1000－1200，室温，反应1小时
5. PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6. 加入二抗 1:5000，室温，反应1小时。
7. PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六．化学发光试剂检测
1. 混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2. 放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3. 显影后清水漂洗，再定影。
七．所用试剂
1· 匀浆缓冲液 4×1L
称 NaH2PO4（·H2O） 12.48g dw 800ml
Na2PO4·12H2O 114.6g ＋ adjust pH to 7.0
NaCl 3.6g adjust Vol to 1 L
（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul.
2. 系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
500ug / ml BSA NS 蛋白浓度ug / ml
S1 50 ul 1.95 ml 12.5
S2 100 ul 1.90 ml 25
S3 200 ul 1.80 ml 50
S4 400 ul 1.60 ml 100
S5 800 ul 1.20 ml 200
3. 30%Acrylamide
29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60 mlDDW，调Vol ?100 ml.
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
称Tris 36.3g溶于水?100 ml，调pH?8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
称Tris5.98g溶解后，调pH?6.7，调体积?100ml
6. Samples buffer 10ml
10%SDS 2 ml
甘油 1 ml
0.5M Tris 1.6 ml 用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚兰、0.5% DTT贮备液。
DDW 5.2 ml

7. 电转液 1L pH 8.2－8.3
Glycine 14.42 g
Tris base 3.02 g
dH2O 800 ml
Methanol 200 ml
10% SDS 2 ml

8. pH 7.2 PBS 2 L
NaCl 18.0g
KCl 0.44g 加DW?2 L
Na2HPO4 2.84g（7.16g）
NaH2PO4 0.432g（0.562g）

9. 10×电极缓冲液 400 ml pH 8.4
Tris base 12.2 g ＋DW 400 ml 调pH 8.4，用前加SDS 0.1%
甘氨酸 57.76 g

10. 脱色液1号
甲醇 250 ml
冰醋酸 50 ml ＋DW?500 ml

11. 脱色液2号
甲醇 100 ml
冰醋酸 75 ml ＋DW?1000 ml